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Die Art und Weise, wie Effekte gleichzeitiger Mutationen zusammenwirken, um die Enzymaktivität zu verändern, ist nicht leicht vorhersehbar, da diese Effekte nicht immer linear additiv sind.Daher kann die Charakterisierung der Auswirkungen gleichzeitiger Mutationen von Aminosäureresten, die das Substrat binden, einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Substratspezifität von Enzymen leisten.In der Beta-Glycosidase von Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) interagieren beide Reste Q39 und E451 mit dem Substrat und dies ist für die Definition der Substratspezifität wesentlich.Doppelmutanten von Sfbetagly (A451E39, S451E39 und S451N39) wurden durch ortsspezifische Mutagenese hergestellt, in Bakterien exprimiert und mittels Affinitätschromatographie gereinigt.Diese Enzyme wurden unter Verwendung von p-Nitrophenyl-beta-Galactosid und p-Nitrophenyl-beta-Fucosid als Substrate charakterisiert.Das k cat/Km-Verhältnis für Einzel- und Doppelmutanten von Sfbetagly, die ortsspezifische Mutationen an den Positionen Q39 und E451 enthalten, wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Wirkung der Doppelmutationen (Gdouble) auf die freie Energie von ESdouble dagger (Enzym-Übergangszustandskomplex) vorliegt daggerxy) ist nicht die Summe der Effekte, die sich aus den einzelnen Mutationen (Gdouble daggerx und Gdouble daggery) ergeben.Dieser Unterschied in Gdouble Dagger weist darauf hin, dass sich die Auswirkungen der einzelnen Mutationen teilweise überschneiden.Daher zählt dieser gemeinsame Effekt in Gdouble daggerxy nur einmal.Kristallographische Daten zu Beta-Glycosidasen zeigen das Vorhandensein einer zweizähnigen Wasserstoffbrücke zwischen den Resten Q39 und E451 und derselben Hydroxylgruppe des Substrats.Daher legen sowohl thermodynamische als auch kristallographische Daten nahe, dass die Reste Q39 und E451 einen gegenseitigen Einfluss auf ihre jeweiligen Wechselwirkungen mit dem Substrat ausüben.