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Monogalactopyranoside von Fluorescein und Fluoresceinmethylester: Synthese, enzymatische Hydrolyse durch biotnylierte β-Galactosidase und Bestimmung des Translationsdiffusionskoeffizienten

Fluoresceinmonoglycoside (d-Galactopyranosid (FMG) und d-Glucopyranosid) und deren Methylester (MFMG) wurden aus Acetobromglucose/Galactose und Fluoresceinmethylester in guten Ausbeuten hergestellt.Es wurden enzymatische Hydrolyseexperimente (unter Verwendung biotinylierter β-Galactosidase) der Galacto-Derivate durchgeführt und kinetische Parameter berechnet.Während der Hydrolyse wurde ein 15–20-facher Anstieg der Fluoreszenzintensität beobachtet.Bei kurzer Zeit und geringer Substratkonzentration wurde ein linearer Anstieg der Fluoreszenz festgestellt, was diese Verbindungen zu nützlichen und empfindlichen Sonden für Galaktosidasen macht.Der Wert der Michaelis-Menten-Konstante (Km) für MFMG ist höher als der von FMG, was auf eine mögliche Konformationsänderung des fluorogenen Substrats schließen lässt.Der Km-Wert für biotinyliertes β-Gal mit FMG ist niedriger als der für das native Enzym.Diese Beobachtung weist auf eine höhere Substrataffinität des biotinylierten Enzyms im Vergleich zum nativen Enzym hin.Mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie wurden translatorische Diffusionskoeffizienten sowohl für fluorogene Substrate als auch für beide Produkte gemessen.Es wurde gemessen, dass die Translationsdiffusionskoeffizienten für fluorogene Substrate und die enzymatischen Hydrolyseprodukte ähnlich sind und im Bereich von 3,5–4,5 × 10−10 m2 s−1 liegen.Daher ist eine Verstärkung oder Verzögerung der enzymatischen Kinetik aufgrund der unterschiedlichen Translationsmobilität von Substrat und Produkt nicht so offensichtlich.