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Einer der Faktoren, die die klinische Anwendung der regenerativen Medizin bei degenerativen Knorpelerkrankungen verhindern, ist eine geeignete Zellquelle.Chondrozyten, der einzige Zelltyp von Knorpel, werden in vitro unter Kulturbedingungen gezüchtet, um die Zellzahl zu erhöhen, und verlieren ihren Phänotyp sowie die Fähigkeit, hyalines Knorpelgewebe zu erzeugen.In dieser Studie stellen wir fest, dass ein serum- und wachstumsfaktorfreies dreidimensionales (3D) Kultursystem die Fähigkeit der passagierten Chondrozyten wiederherstellt, in vitro Knorpelgewebe zu bilden, ein Prozess, an dem sox9 beteiligt ist. Gelenkchondrozyten vom Rind wurden zweimal passagiert ermöglichen eine Zellzahlerweiterung (P2) und werden in hoher Dichte auf 3D-Kollagen-Typ-II-beschichteten Membranen in Medien mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit Insulin und Dexamethason (SF3D), kultiviert.Die Zellen wurden nach Monolayer-Expansion und anschließender 3D-Kultur durch Durchflusszytometrie, Genexpression und Histologie charakterisiert.Die frühen Veränderungen der Signaltransduktionswege während der Redifferenzierung wurden charakterisiert. Die P2-Zellen zeigten ein Vorläufer-ähnliches Antigenprofil von 99 % CD44(+) und 40 % CD105(+) und ein Genexpressionsprofil, das auf Interzonenzellen schließen lässt.P2 in SF3D exprimierte chondrogene Gene und akkumulierte extrazelluläre Matrix.Die Herunterregulierung des Insulinrezeptors (IR) mit HNMPA-(AM3) oder des PI-3/AKT-Kinasewegs (aktiviert durch Insulinbehandlung) mit Wortmannin hemmte die Kollagensynthese.HNMPA-(AM3) reduzierte die Expression der Gene Col2, Col11 und IR sowie Sox6 und -9.Co-Immunpräzipitations- und Chromatin-Immunpräzipitationsanalysen von HNMPA-(AM3)-behandelten Zellen zeigten eine Bindung der Coaktivatoren Sox6 und Med12 mit Sox9, verringerten jedoch die Sox9-Col2a1-Bindung. Wir beschreiben eine neuartige Kulturmethode, die eine Erhöhung der Anzahl von Chondrozyten ermöglicht und fördert Bildung von hyalinem Knorpelgewebe, teilweise durch Insulin-vermittelte Sox9-Col2a1-Bindung.Die Eignung des auf diese Weise erzeugten Gewebes für den Einsatz bei der Gelenkreparatur muss in vivo untersucht werden.