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Neuer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Assay für Glykosyltransferasen basierend auf Derivatisierung mit Anthranilsäure und Fluoreszenzdetektion.

Mithilfe der einzigartigen Markierungschemie von 2-Aminobenzoesäure (2AA; Anthranilsäure, AA) wurden Assays entwickelt, um die Aktivitäten von β1-4-Galactosyltransferase (GalT-1) und α2-6-Sialyltransferase (ST-6) durch Hochleistungsflüssigkeit zu messen Chromatographie (HPLC) mit Fluoreszenzdetektion (Anumula KR. 2006. Fortschritte in Fluoreszenzderivatisierungsmethoden für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographieanalyse von Glykoproteinkohlenhydraten. Anal Biochem. 350:1-23).N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und N-Acetyllactosamin wurden als Akzeptoren und Uridindiphosphat (UDP)-Galactose und Cytidinmonophosphat (CMP)-N-Acetylneuraminsäure (NANA) als Donoren für GalT-1 bzw. ST-6 verwendet.Enzymatische Produkte wurden in situ mit AA markiert und auf einer TSKgel Amide 80-Säule unter Normalphasenbedingungen von den Substraten getrennt.Aus den Peakflächen wurden Enzymeinheiten durch Vergleich mit den gleichzeitig derivatisierten Standards Gal-β1-4GlcNAc und NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc bestimmt.Für die Tests wurden Linearität (Zeit und Enzymkonzentration), Präzision (Intra- und Interassay) und Reproduzierbarkeit ermittelt.Die Tests erwiesen sich als nützlich für die Überwachung der Enzymaktivitäten während der Isolierung und Reinigung.Die Tests waren hochempfindlich und erzielten eine gleichwertige oder sogar bessere Leistung als die herkömmlichen Messungen auf der Basis radioaktiven Zuckers.Das Assay-Format kann auch zur Messung der Aktivität anderer Transferasen verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Kohlenhydratakzeptoren ein reduzierendes Ende zur Markierung enthalten.Unter Verwendung von IgG wurde ein Assay für Glykoproteinakzeptoren entwickelt.Für die Trennung von IgG-Glykanen (biantennäres G0, G1, G2, mono- und disialyliert) wurde eine kurze HPLC-Profiling-Methode entwickelt, die die schnelle Bestimmung der GalT-1- und ST-6-Aktivitäten ermöglichte.Darüber hinaus sollte sich diese Profilierungsmethode für die Überwachung der Veränderungen von IgG-Glykanen im klinischen Umfeld als nützlich erweisen.