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Mechanistische Einblicke in eine Ca2+-abhängige Familie von Alpha-Mannosidasen in einem menschlichen Darmsymbionten.

Dickdarmbakterien, am Beispiel von Bacteroides thetaiotaomicron, spielen eine Schlüsselrolle bei der Erhaltung der menschlichen Gesundheit, indem sie große Familien von Glycosidhydrolasen (GHs) nutzen, um Nahrungspolysaccharide und Wirtsglycane als Nährstoffe zu nutzen.Ein Beispiel für eine solche Erweiterung der GH-Familie sind die 23 Glykosidasen der GH92-Familie, die vom Genom von B. thetaiotaomicron kodiert werden.Hier zeigen wir, dass es sich um Alpha-Mannosidasen handelt, die über einen einzigen Verdrängungsmechanismus wirken, um N-Glykane des Wirts zu nutzen.Die dreidimensionale Struktur von zwei GH92-Mannosidasen definiert eine Familie von Zweidomänenproteinen, bei denen sich das katalytische Zentrum an der Domänenschnittstelle befindet und die Hydrolyse in einem Ca(2+)- abhängige Art und Weise.Die dreidimensionalen Strukturen der GH92 im Komplex mit Inhibitoren geben Einblick in die Spezifität, den Mechanismus und den Konformationsverlauf der Katalyse.Ca(2+) spielt eine wichtige katalytische Rolle bei der Verzerrung des Mannosids weg von seiner (4)C(1)-Sesselkonformation im Grundzustand in Richtung des Übergangszustands. (Bibliographie: Nat.Chem.Biol.6, 125-32, (2010）

Frontale Affinitätschromatographie von Ovalbumin-Glycoasparaginen auf einer Concanavalin-A-Sepharose-Säule.Eine quantitative Untersuchung der Bindungsspezifität des Lektins.

Die Wechselwirkungen von Sepharose 4B-immobilisiertem Concanavalin A (ConA) mit 10 aus Ovalbumin abgeleiteten Glycosparaginen wurden quantitativ durch frontale Affinitätschromatographie untersucht.Bei dieser Methode wird eine Kohlenhydratlösung kontinuierlich auf eine ConA-Sepharose-Säule aufgetragen und die Verzögerung der Elutionsfront als Parameter für die Stärke der Wechselwirkung gemessen.Die Dissoziationskonstante (Kd) für jedes Saccharid mit ConA kann bestimmt werden.Eine Analyse der Bindung von p-Nitrophenyl-alpha,D-mannosid hat gezeigt, dass sich die Bindungseigenschaften von ConA nach der Immobilisierung auf Sepharose 4B nicht wesentlich ändern.Jedes der Ovalbumin-Glycoasparagine wurde zur Analyse durch die reduktive Methylierungsmethode mit Tritium markiert.Ein Vergleich der erhaltenen Kd-Werte ergab, dass die Bindung von ConA bei sehr geringen strukturellen Unterschieden der Glycosylkette erheblich variiert.Die Ergebnisse legen nahe, dass ConA eine spezifische Glykosylkettenstruktur erkennt, Man alpha 1-6(Man alpha 1-3)Man, in der mindestens eine Hydroxylgruppe an der C-3-Position der C-6-verknüpften Mannose frei sein sollte.