Produkte

Um mehrere Metaboliten von 5-Fluorouracil (5-FU) und zwei endogene Monophosphatnukleotide spezifisch zu quantifizieren, haben wir eine Originalmethode entwickelt, die auf einer Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) basiert.Dieser Assay ermöglichte die Bestimmung von: (i) der intrazellulären Produktion von 5-Fluor-2′-desoxyuridin-5′-monophosphat (5-FdUMP) aus 5-FU oder 5-Fluor-2′-desoxyuridin (5-FdUrd) , (ii) der Einfluss der 5-FdUMP-Konzentration auf das intrazelluläre Verhältnis von 2′-Desoxyuridin-5′-monophosphat (dUMP)/Thymidin-5′-monophosphat (TMP) und (iii) das Sekretionsausmaß von 5-FdUMP und 5-FU aus menschlichen kultivierten Zellen durch ABC-Transporter.Unter unseren Versuchsbedingungen wurden die Zellen mit 5-FU oder 5-FUrd inkubiert.Anschließend wurden die Zellproteine ​​mit Methanol ausgefällt.Dieses Verfahren lieferte eine hohe Extraktionsausbeute.Um die 5-FU- und 5-FdUMP-Sekretion aus Zellen zu messen, führten wir außerdem eine Quantifizierung dieser Moleküle im Kulturmedium durch.Die Medien wurden entweder direkt injiziert (5-FU) oder einer Festphasenextraktion mit der Oasis Wax-Extraktionskartusche (5-FdUMP) unterzogen.Die Trennung der Analyten erfolgte auf einer dC18 Atlantis 3,5 μm (100 mm × 2,1 mm ID)-Säule im isokratischen Modus unter Verwendung von Ammoniumformiatpuffer/Methanol/Wasser (5/5/90, Vol./Vol.) als mobile Phase.Die Laufzeit betrug nicht mehr als 6,2 Minuten.Die Analyten wurden in einer Elektrospray-Schnittstelle im Negativionenmodus ionisiert.Wir haben die Methode je nach Verbindung über einen Bereich von 2,5–150 ng mL −1 validiert.Die Intra- und Inter-Assay-Variabilität lag über sieben Tage bei weniger als 10 %.Alle Verbindungen waren in Zellen oder im Kulturmedium stabil, wenn die Proben mindestens zwei Wochen lang bei –20 °C und nach drei Einfrier-Auftau-Zyklen gelagert wurden.In beiden Medien wurde kein Matrixeffekt beobachtet.