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Die Analyse proteomweiter Phosphorylierungsereignisse stellt aufgrund der enormen Komplexität von Proteinphosphorylierungsnetzwerken immer noch eine große analytische Herausforderung dar.In dieser Arbeit bewerten wir die Komplementarität von Lys-N, Lys-C und Trypsin im Hinblick auf ihre Fähigkeit, zur globalen Analyse des Phosphoproteoms beizutragen.Eine verfeinerte Version des starken Kationenaustauschs bei niedrigem pH-Wert wurde verwendet, um N-terminal acetylierte, phosphorylierte und nicht modifizierte Peptide effizient zu trennen.Mit einer Kombination der drei Enzyme konnten aus 1 mg Protein insgesamt 5036 nichtredundante Phosphopeptide mit einer Falscherkennungsrate von <1 % identifiziert werden.Unsere Daten zeigten, dass die Überlappung zwischen den mit verschiedenen Proteasen generierten Phosphopeptid-Datensätzen marginal war, wohingegen die Überlappung zwischen zwei ähnlich generierten tryptischen Datensätzen mindestens viermal höher war.Auf diese Weise ermöglichte die parallele Verwendung von Lys-N und Trypsin einen Anstieg der Anzahl nachgewiesener Phosphopeptide um 72 % im Vergleich zu Trypsin allein, während ein Trypsin-Replikationsexperiment nur zu einem Anstieg von 25 % führte.Als wir uns ausschließlich auf die Trypsin- und Lys-N-Daten konzentrierten, identifizierten wir 4671 nichtredundante Phosphopeptide.Eine weitere Analyse der erkannten Stellen zeigte, dass die Lys-N- und Trypsin-Datensätze mit deutlich unterschiedlichen Phosphorylierungsmotiven angereichert waren, was ein weiterer Beweis dafür ist, dass Multiprotease-Ansätze bei Phosphoproteom-Analysen sehr wertvoll sind.